ADC藥物純化解決方案
抗體偶聯(lián)藥物(Antibody Drug Conjugate，ADC)由靶向特異性抗原的單克隆抗體與小分子細胞毒性藥物通過連接子鏈接而成，兼具傳統(tǒng)小分子化藥的強大殺傷效應(yīng)及抗體藥物的腫瘤靶向性，由抗體(Antibody)、連接子(Linker)、有效載荷(Payload)毒素分子三部分組成。理想的ADC分子應(yīng)當(dāng)具有高靶向性，精準(zhǔn)結(jié)合目標(biāo)靶點，毒素分子可以從血漿中穩(wěn)定通過并到達目的地(例如癌細胞)再釋放，發(fā)揮毒素分子的作用。因而這三個組成部分對藥物使用效果都有至關(guān)重要的影響：抗體的靶點選擇、特異性、親和力、內(nèi)化效率，可降解連接子的穩(wěn)定性、不可降解連接子與小分子毒素復(fù)合物對腫瘤細胞的殺傷力、連接子與抗體的偶聯(lián)方式，以及小分子毒素的選擇是ADC藥物開發(fā)過程中的主要考量點。
ADC藥物結(jié)構(gòu)示意圖*
ADC藥物的偶聯(lián)方式
隨著抗體制備技術(shù)和偶聯(lián)技術(shù)的不斷進步，現(xiàn)階段的ADC候選藥物已經(jīng)克服了一系列問題，如藥物靶向性不足、藥物毒性大、異質(zhì)性高、連接子不穩(wěn)定等。此外，藥物抗體比(drug-antibody ratio，DAR)大于4的ADC存在耐受性低、體內(nèi)療效低以及血漿清除率高的問題，因此優(yōu)化偶聯(lián)技術(shù)，控制DAR值是目前ADC藥物研究的重要方向，而位點特異性偶聯(lián)(site-specific conjugation)技術(shù)是解決ADC藥物關(guān)鍵質(zhì)量屬性DAR的關(guān)鍵。經(jīng)過三代技術(shù)的革新，位點特異性偶聯(lián)技術(shù)逐漸成熟，表1中總結(jié)常見集中偶聯(lián)方式及其特點。此外，偶聯(lián)技術(shù)整體決定可能引入的工藝相關(guān)雜質(zhì)，因而偶聯(lián)技術(shù)的選擇與下游純化方案息息相關(guān)，根據(jù)不同的偶聯(lián)方式可推測出偶聯(lián)后將采用的純化方案(見表1)。
常見ADC藥物偶聯(lián)方式及其特點*
ADC藥物由抗體與有效載荷相結(jié)合，已上市ADC藥物中均以單抗作為ADC靶向偶聯(lián)抗體，有效載荷主要為細胞毒藥物(已上市藥物主要有微管抑制劑、DNA損傷劑為主)，具有強細胞毒性，進入體內(nèi)如果發(fā)生脫靶(off-target)對正常細胞有較高損傷，因而需要保證ADC藥物中游離細胞毒分子控制在很低水平且保證ADC較小的脫靶情況，盡可能減小藥物的毒副作用。下游純化是保證藥物質(zhì)量的重要方式，對于不同的偶聯(lián)方式以及產(chǎn)生的對應(yīng)雜質(zhì)，需配合合理的純化工藝以保證終產(chǎn)品的質(zhì)量。
偶聯(lián)反應(yīng)常見引入雜質(zhì)及去除方法
ADC藥物生產(chǎn)及下游純化
隨著ADC藥物偶聯(lián)技術(shù)的發(fā)展，ADC藥物的偶聯(lián)工藝逐漸從隨機偶聯(lián)演進為現(xiàn)代定點偶聯(lián)，對應(yīng)的藥物制備工藝分別為化學(xué)法偶聯(lián)制備和酶法偶聯(lián)制備兩大類，化學(xué)法偶聯(lián)主要為隨機偶聯(lián)，以賴氨酸偶聯(lián)和半胱氨酸偶聯(lián)為代表，技術(shù)相對成熟，工藝開發(fā)時間較短，藥物制備流程(如下圖2)伴隨毒素小分子、聚集體等雜質(zhì)產(chǎn)生，一般采用TFF、陽離子交換層析(CEX)去除，可選疏水層析(HIC)進行DAR值控制，去除異質(zhì)體;賽分科技推薦陽離子交換填料Agarosix HC75-S和疏水填料Monomix MC30-HIC Butyl，高效純化獲得高純度樣品。
化學(xué)法偶聯(lián)制備ADC藥物的生產(chǎn)及純化流程
酶法偶聯(lián)制備ADC藥物，定點偶聯(lián)可有效解決化學(xué)偶聯(lián)的異質(zhì)性問題，DAR和位點均一性好，批次間一致性高，具有更好的穩(wěn)定性。實際生產(chǎn)中可分為一步偶聯(lián)和兩步或多步偶聯(lián)兩種(如下圖3)，一步偶聯(lián)后的ADC粗品常采用親和層析加陽離子交換層析進行純化，去除殘留的酶、未反應(yīng)的裸抗等雜質(zhì);兩步或多步偶聯(lián)法中先將Linker加到抗體上，形成中間體，中間體的純化常選用親和層析加陽離子交換層析的方法，之后再將有效載荷Payload與中間體上的Linker結(jié)合，形成ADC粗品，ADC粗品可選擇切向流過濾(TFF)或陽離子交換層析，去除未反應(yīng)的小分子Payload、酶反應(yīng)中的小分子副產(chǎn)物、鹽離子以及進行緩沖液交換，最后得到ADC的終產(chǎn)物。賽分科技推薦親和填料MabPurix A65 Excel和陽離子交換填料Agarosix HC75-S或Monomix Mab60-SP，具有高載量、高純度和高回收率的優(yōu)勢，為ADC藥物下游純化工藝優(yōu)化保駕護航。
有效載荷毒素分子的生產(chǎn)過程中的下游純化通常采用正向相層析或反相層析去除，賽分科技推薦的硅膠基質(zhì)HP-Silica正相填料、BR-C18(2)反相填料和聚合物PolyRP反相填料。
酶法偶聯(lián)制備ADC藥物的生產(chǎn)及純化流程
ADC藥物純化推薦填料
Monomix MC30-HIC Butyl疏水填料
ADC偶聯(lián)后存在不同DAR值樣品具有疏水性差異，理論上可選擇疏水層析介質(zhì)用于純化不同DAR樣品。實際操作中，疏水層析填料需要極高的分辨率(小粒徑填料)才能保證分離不同的DAR值的樣品。
填料特點
高機械穩(wěn)定性，良好的耐壓性能
適中的疏水性
高化學(xué)穩(wěn)定性，可耐受pH 2-13
高分辨率、高回收率
MabPurix A65 Excel親和填料
裸抗與毒素分子偶聯(lián)方案中采用酶的情況下，多采用親和+離子交換的方法純化ADC藥物。MabPurix A65 Excel具有高載量、高回收率，對于單抗、雙抗以及ADC樣品具有良好的純化效果。
填料特點
高載量,其中A65 Excel動態(tài)載量高達70 mg hlgG/mL resin
低Protein A脫落，高HCP去除效率
高交聯(lián)度，耐壓達0.3 MPa
有效去除聚集體，降低后續(xù)純化壓力
填料反壓低，易于放大
Agarosix HC75-S離子交換填料
Agarosix HC75-S為強陽離子交換填料，填料表面的高度親水性使得樣品與固定相間的非特異性吸附降至最低。高交聯(lián)基球的基架，使Agarosix HC75-S具有良好的壓力/流速特性，廣泛適合于單抗、雙抗及偶聯(lián)后的ADC藥物的下游純化。
填料特點
高結(jié)合載量和極好的生物相容性
高效去除聚集體
高分辨率、高柱效和高回收率
易于放大
Monomix Mab60-SP離子交換填料
Monomix Mab60-SP為強陽離子交換填料，具有高分辨率、高載量，對于ADC藥物中裸抗以及偶聯(lián)后藥物的純化均應(yīng)用廣泛。將填料保存于DMSO溶劑中一周后再測試其DBC，結(jié)果顯示無顯著變化(100.2%)，該填料對DMSO表現(xiàn)出有良好的溶劑耐受性。
填料特點
剛性基質(zhì)可耐受高壓和高流速
高結(jié)合載量、高分辨率、高柱效和高回收率
高度親水性表面，可忽略的非特異性吸附
常規(guī)裝柱條件下，體積變化小
HP-Silica正相填料
HP-Silica正相填料采用高純度的硅膠為基質(zhì)，具有高選擇性、高分辨率和高重現(xiàn)性，采用極性固定相，可與極性化合物發(fā)生作用，非常適合于分離各種化學(xué)物質(zhì)，如多肽、蛋白、糖類、核苷酸、維生素、類固醇、極性藥物分子和酸、中、堿性有機化合物等。ADC藥物常用毒素分子純化推薦粒徑10 μm、孔徑120 Å的HP-Silica填料。
填料特點
采用高純硅膠作為原料(金屬雜質(zhì)<10 ppm)
高的化學(xué)穩(wěn)定性，低固定相流失高的選擇性和分離效率
高上樣量，高機械強度
BR-C18(2)硅膠反相填料
BR-C18填料以高純度球形硅膠為基質(zhì)，具有良好的耐堿性能、耐壓性好、反壓低及高流速下分辨率良好等特點，ADC藥物有效載荷常用毒素分子的純化推薦粒徑8 μm、孔徑100 Å的BR-C18(2)填料。
填料特點
以高純硅膠為原料
高載量、高機械強度
高的選擇性和分離效率
高度批間重現(xiàn)性，易于放大
PolyRP聚合物反相填料
PolyRP-10-100填料(粒徑10 μm、孔徑100 Å)采用高交聯(lián)度的聚苯乙烯/二乙烯基苯(PS/DVB)作為基質(zhì)，基質(zhì)骨架本身就具有的強疏水性能，使其具有粒徑分布均一、粒徑可控、耐受pH范圍寬等優(yōu)點。
填料特點
良好的物理及化學(xué)穩(wěn)定性料
剛性基質(zhì)可耐受高壓和高流速
高分辨率、高柱效和高回收率
高度批間重現(xiàn)性，易于放大
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