文獻(xiàn)速遞 | HIC色譜法實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)ADC藥物偶聯(lián)反應(yīng)
引言 Introduction
抗體偶聯(lián)藥物（ADC）是一類將抗體和細(xì)胞毒性的小分子藥物通過(guò)連接子偶聯(lián)而成的生物藥。在其偶聯(lián)反應(yīng)過(guò)程中，反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)和底物當(dāng)量等因素會(huì)直接影響關(guān)鍵質(zhì)量屬性DAR值。過(guò)程分析技術(shù)（PAT）為實(shí)時(shí)追蹤ADC的生物偶聯(lián)過(guò)程提供了解決方案。近期，賽分科技的合作伙伴默克發(fā)表相關(guān)文章“Process Analytical Technology for Real-Time Monitoring of Pharmaceutical Bioconjugation Reactions”，闡述了一種利用疏水相互作用色譜（HIC）技術(shù)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)ADC偶聯(lián)反應(yīng)的創(chuàng)新方法，文獻(xiàn)中采用高疏水性色譜柱Proteomix HIC Phenyl-NP5，實(shí)現(xiàn)對(duì)裸抗和不同DAR值樣品的高效分離，為ADC藥物的研發(fā)提供了更精確、高效的監(jiān)測(cè)手段。
背景介紹
隨著生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展，過(guò)程分析技術(shù)（PAT）已成為監(jiān)測(cè)藥物生產(chǎn)過(guò)程的重要措施，通過(guò)對(duì)生產(chǎn)過(guò)程中的關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控和分析，及時(shí)發(fā)現(xiàn)并糾正潛在問(wèn)題，從而確保最終產(chǎn)品的質(zhì)量和安全性。近年來(lái)，多種分析技術(shù)已被應(yīng)用于ADC藥物DAR值的分析與表征，其中，HIC法以分辨率高、色譜條件溫和等特點(diǎn)脫穎而出，它的作用機(jī)理主要是利用ADC藥物與未偶聯(lián)抗體在疏水性上的差異進(jìn)行分離，疏水性低的未偶聯(lián)抗體首先被洗脫，偶聯(lián)小分子后的ADC疏水性增加，洗脫時(shí)間延遲。且HIC法能夠精確地捕捉到載藥量的細(xì)微差異，故通常作為檢測(cè)ADC藥物分布、裸抗含量及平均DAR值的標(biāo)準(zhǔn)方法。
文章概述
文獻(xiàn)中ADC藥物的生物偶聯(lián)反應(yīng)（Bioconjugation Reaction）選擇極性非質(zhì)子溶劑DMSO（二甲亞砜），可有效溶解疏水性較強(qiáng)的小分子藥物及部分親水性成分，提供了一個(gè)理想的偶聯(lián)反應(yīng)體系。當(dāng)還原后的單克隆抗體（mAb）進(jìn)入該體系時(shí)，原本由二硫鍵連接的游離半胱氨酸殘基得以釋放，與馬來(lái)酰亞胺連接子的活性基團(tuán)發(fā)生特異性反應(yīng)，形成了穩(wěn)定的硫酯鍵。研究中探索了一種偶聯(lián)反應(yīng)的HIC-HPLC監(jiān)測(cè)方法，結(jié)合PAT技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)節(jié)，并采用Proteomix HIC Phenyl-NP5色譜柱進(jìn)行分析，該色譜柱固定相為苯基鍵合聚苯乙烯/二乙烯基苯（PS/DVB），具有高疏水性，準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)反應(yīng)過(guò)程中DAR值變化，從而實(shí)現(xiàn)控制終產(chǎn)物反應(yīng)至理想狀態(tài)的目標(biāo)。
實(shí)驗(yàn)方案
Column: Proteomix HIC Phenyl-NP5（5μm, 4.6x100 mm）
Sample: Small Molecule Conjugation
Mobile Phase:
A:3M ammonium acetate, 50mM potassium phosphate, 5% acetonitrile, pH 7.0
B: 5% acetonitrile
Flow Rate: 0.25 mL/min
Temperature: 30°C
Detection: UV at 280 nm
Amount: 50 μg
圖1.偶聯(lián)過(guò)程中形成的三種DAR組分的疏水相互作用色譜（HIC）分離
圖1代表偶聯(lián)反應(yīng)中mAb與不同當(dāng)量LP（Linker-Payload）生成的3種DAR產(chǎn)物經(jīng)Proteomix HIC Phenyl-NP5的分離效果。A對(duì)應(yīng)mAb與不同當(dāng)量的LP反應(yīng)生成的產(chǎn)物，圖B、C、D色譜圖分別對(duì)應(yīng)低、中、高當(dāng)量LP的反應(yīng)結(jié)果，色譜圖中黃色、藍(lán)色和紫色星星分別對(duì)應(yīng) DAR0、DAR1和 DAR2。根據(jù)各當(dāng)量的平均DRA值，可以得出要想達(dá)到目標(biāo)DAR值2.0，必須采用高當(dāng)量LP進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論
綜上所述，Proteomix HIC Phenyl-NP5分析方法不僅能有效監(jiān)測(cè)ADC藥物偶聯(lián)反應(yīng)過(guò)程，還可評(píng)估不同當(dāng)量LP的反應(yīng)效果，有助于優(yōu)化ADC藥物的生物偶聯(lián)反應(yīng)條件，以達(dá)到期望的目標(biāo)DAR值，同時(shí)可降低下游純化難度，這對(duì)于ADC藥物合成工藝重要的意義。
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